花生 AhCDPK32 基因克隆及表达载体的构建

张青云<sup>1</sup> 张青云; 孙全喜<sup>2</sup> 孙全喜; 唐月异<sup>2</sup> 唐月异; 王秀贞<sup>2</sup> 王秀贞; 吴琪<sup>2</sup> 吴琪; 王云云<sup>1</sup> 王云云; 曹广英<sup>1</sup> 曹广英; 祁雪<sup>1</sup> 祁雪; 王传堂<sup>1</sup> 王传堂

研究报告

花生 AhCDPK32 基因克隆及表达载体的构建

张青云¹

, 孙全喜²

, 唐月异²

, 王秀贞²

, 吴琪²

, 王云云¹

, 曹广英¹

, 祁雪¹

, 王传堂¹

1吉林农业大学, 长春, 130118;
2山东省花生研究所, 青岛, 266100

作者

通讯作者
豆科基因组学与遗传学, 2016 年, 第 7 卷, 第 5 篇
收稿日期: 2016年02月21日接受日期: 2016年03月02日发表日期: 2016年03月29日

推荐引用：

引用格式(中文):

张青云, 孙全喜, 唐月异, 王秀贞, 吴琪, 王云云, 曹广英, 祁雪, 王传堂, 2016, 花生 AhCDPK32 基因克隆及表达载体的构建, 分子植物育种, 14(5): 1171-1178

引用格式(英文):

Zhang Q.Y., Sun Q.X., Tang Y.Y., Wang X.Z., Wu Q., Wang Y.Y., Cao G.Y., Qi X., and Wang C.T., 2016, Cloning and Expression Vector Construction of AhCDPK32 Gene from Peanut (Arachis hypogaea L.), Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 14(5): 1171-1178

摘要

利用 RT-PCR 方法，从花生品种 “汕油 21” 成熟种子中克隆了钙依赖蛋白激酶(camcium-dependentprotein kinase, CDPK)基因 AhCDPK32，该序列包含 1 617 bp 开放阅读框，共编码 538 个氨基酸。核苷酸序列在 NCBI 中进行 Blast 比较，结果显示与大豆 GmCDPK32 (GenBank 登录号为 XM_003554131)基因同源性为87%。生物信息学分析结果，预测蛋白质分子量为 60.807 kD，蛋白质等电点(PI)为 6.96，蛋白质信号肽分析和疏水性分析，表明信号肽剪切可能性小，蛋白质具亲水性。我们构建了该基因超表达载体 pCambiaAhCDPK32，为进一步研究该基因的功能提供了理论基础。这是第一次在花生中克隆到 CDPK 基因的报道。

关键词

花生；钙依赖蛋白激酶；进化树；疏水性分析

花生制品早已是人们普遍接受的食物，花生籽仁脂肪含量50%左右，其中油酸和亚油酸约占80%。我国花生多种植于旱薄地，易遭受干旱、病虫害、低温、营养元素匮乏等胁迫影响，造成产量和品质下降。通过基因工程技术，改良花生品质，增强花生的抗逆性，是花生育种工作的重要方向。

植物生长繁殖过程经历种子萌发、生长分化、开花结果，钙在植物每个生长阶段都着发挥重要作用。花生缺钙时，生殖生长受到限制，花生植株矮小、花败育、根系弱小、荚果萎缩腐烂等症状(王传堂和张建成, 2013)。外界环境胁迫会引起细胞内钙离子浓度瞬时变化，这种变化能够被钙离子受体或钙离子锚定蛋白接收并解码，钙离子锚定蛋白将这种信号通过下游反应进行级联放大，例如相应基因的调控表达及蛋白磷酸化(Sanders et al., 2002)。钙依赖蛋白激酶(camcium-dependent protein kinase, CDPK)存在于多种植物、藻类及原生生物中，CDPK在植物体内重要作用之一就是参与环境胁迫信号转导。寒冷、干旱、高盐、营养匮乏等都能引起 CDPK基因特异性表达和CDPKmRNA特异性积累(Breviario et al., 1995; Mitra and Johri, 2000)。

Weckwerth等(2014)在玉米中分离出39个CDPK基因家族成员，Zmcpk1和Zmcpk25 在玉米寒冷胁迫响应中起到重要的作用。研究表明，过量表达水稻OsCPK7基因可以提高转基因水稻的抗寒性，Os－CPK13可以提高水稻的耐盐性和抗旱性(Abbasi et al.,2004)。研究发现 AtCPK6 是响应高盐和干旱胁迫的正调控因子(Xu et al., 2010)。过量表达水稻的 OsCDPK12基因提高了水稻的耐盐性，但易受真菌感染(Asano et al., 2012)。迄今在拟南芥中分离得到34个CDPK 基因，水稻中得到31个，小麦中获得了20个，并且很多基因功能都已得到验证(Liu et al., 2014)。

1 结果与分析

1.1 AhCDPK32 基因的克隆

设计引物AhCDP K32-F和AhCDPK32-R，以“汕油 21”第一链cDNA为模板扩增出1 617 bp片段(图1)，共编码538个氨基酸(图2)。该基因序列，在NCBI上进行Blast 比较，结果与大豆已知基因同源性为87% (基因登录号为 XM_003554131)，与棉花已知基因同源性为81% (基因登录号为 XM_0126-15254)。将氨基酸序列进行同源性比较，确定所扩增的AhCDPK32 为花生“汕油 21”的钙依赖蛋白激酶基因。

图1 AhCDPK32 基因扩增片段

图2 AhCDPK32 基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列

1.2 生物信息学分析

利用信号肽分析网站，对花生 AhCDPK32 蛋白进行信号肽剪切位点预测，信号肽分值(图3)较低，结果显示，氨基酸残基发生信号肽剪切可能性较小。对 AhCDPK32 蛋白质进行疏水性分析，结果显示该蛋白具有亲水性(图4)。

将花生的 AhCDPK32 氨基酸序列输入NCBI 进行保守结构域分析，发现具有明显的丝氨酸 / 苏氨酸型蛋白激酶结构域即pkc-like superfamily及两个典型的EF手型结构域(图5)。

利用 DNAMAN 对 AhCDPK32 氨基酸序列与其它物种来源的 CDPK32 氨基酸序列比对，并构建系统发育树(图6; 图7)。

图3 AhCDPK32 信号肽预测

图4 AhCDPK32 疏水性分析

图5 AhCDPK32 氨基酸保守结构域分析

图6花生AhCDPK32氨基酸序列与其它物种CDPK32氨基酸序列比对

图7花生AhCDPK32与其它物种来源的CDPK32系统发育树分析

1.3 植物超表达载体的构建和鉴定

将带有目的 AhCDPK32 基因片段的克隆载体和植物表达载体pCambia2300EC同时用BamHⅠ进行单酶切(图8)，回收带有酶切位点 AhCDPK32 基因片段以及线性化植物表达载体 pCambia2300EC 片段，16℃过夜连接后，连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞，选取阳性克隆进行酶切鉴定正确后，再测序鉴定。结果表明 AhCDPK32 片段已正确地插入到植物表达载体pCambia2300EC 上，pCambia2300EC-AhC- DPK32 酶切鉴定(图9)，载体结构(图10)。

图8 pMD18-T-AhCDPK32和pCambia2300EC质粒酶切

图9 pCambia2300EC-AhCDPK32 质粒酶切

图10 AhCDPK32 基因超表达载体结构

2 讨论

高等植物钙依赖蛋白激酶基因具有庞大的基因家族，多数基因与植物抗性相关，还有一些 CDPK 基因参与花粉管的发育，根的生长，细胞分裂及细胞凋亡。拟南芥突变体中获得 AtCDPK32 基因可以由植物损伤、氯化钠、黑暗诱导表达(Chotikacharoensuk et al., 2006)。拟南芥中过量表达 CDPK32-GFP，发现其与花粉管形成有关联(Zhou et al., 2009)。花生在缺钙条件下，钙依赖蛋白激酶基因参与负转录调控，另外，在花生有丝分裂时期和种子发育阶段，CDPK 也表现出时空表达特性(Jain et al., 2011)。

钙依赖蛋白激酶是单链肽，从 N 端到 C 端具有典型的四个功能结构域，分别为可变区、催化区、连接区和调控区。可变区一般由 20~200 个氨基酸残基组成，很少有同源性，所以保守性很差。催化区有300多个氨基酸残基，同源性比较高，具有典型的丝氨酸 / 苏氨酸型蛋白激酶拥有的 11 个高度保守的亚结构域，即 I-XI区(Hrabak et al., 2003)。连接区由20~30 个氨基酸残基组成，最为保守，调控区具有与钙离子结合的EF手型结构，保守性最低。

AhCDPK32 氨基酸序列保守结构域分析，含有2 个EF手型结构，以及同源性较高的 I-XI 区。表明克隆的该基因是 CDPK 同源基因。AhCDK32 第二位氨基酸为甘氨酸，暗示可能含有与膜定位有关的豆蔻酰化位点(Martin and Busconi, 2008)。由于 AhCD- K32 在花生成熟种子中克隆得到，推测该基因可能参与花生种子的发育或者与某些抗性相关。本实验中构建的 pCambia2300EC-AhCDPK32 超表达载体，为进一步研究该基因在花生中的功能奠定了基础。

3 材料与方法

3.1 植物材料及载体来源

试验所用植物材料花生种子“汕油 21”由山东省花生研究所提供；植物表达载体pCambia2300EC (添加了35S启动子以及Nos终止子的 pCambia2300 载体)由山东农业大学亓宝秀教授馈赠。

3.2 引物和测序

AhCDPK32基因测序所用引物为通用引物 M13-47 和 M13-48。

AhCDPK32 基因克隆所用引物：AhCDPK32-F： 5'-GGATCCATGGGTAACTGCTGCGGGACG-3' ，A- hCDPK32-R：5'-GGATCCTCATCTATGACCCTCATTG-3' (斜体部分的碱基代表 BamHⅠ内切酶识别位点)，本实验所用引物的合成及测序均由上海桑尼测序公司完成。

3.3 目的基因的克隆

利用拟南芥 AtCDPK32 序列( GenBank 登录号 NM_115613.3) 在花生基因组数据库 (http://www. peanutbase.org)中进行 Blast，获得可能的 AhCDPK32 基因序列。根据预测基因开放阅读框，利用 DNA- Club 设计扩增全长的引物 AhCDPK32-F 和 AhCDP-K32-R。

以花生“ 汕油 21” 第一链 cDNA 为模板，以 AhCDPK32-F 和 AhCDPK32-R 为引物进行扩增。 PCR 反应体系为 50 μL：HIFI Mix (北京全式金生物技术有限公司) 25 μL，AhCDPK32-F (10 μmol/L)和AhCDPK32-R (10 μmol/L) 各 2 μL，cDNA (100 ng)2 μL，ddH2O 19 μL。反应程序：94℃ 3 min 预变性，94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，35 个循环数，72℃ 后延伸 10 min。

琼脂糖凝胶检测扩增的基因产物，参照 BIOMI- GA 胶回收说明书回收目的基因片段。用 PCR 仪控温在 16℃，过夜连接回收的目的基因片段与载体 pMD18-T，构成 pMD18-T-AhCDPK32 重组质粒，并转化 Trans-T1 (北京全式金生物技术有限公司)感受态细胞。选择新制备的 100 mg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基(含 IPTG 和 x-Gal)，用涂布器均匀涂布转化产物，37℃培养箱中倒置培养 12 h 后，随机挑取白色单菌落，菌落 PCR 鉴定，挑选阳性克隆测序。

3.4 生物信息学分析

测序结果输入 NCBI 中(http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)，利用 Blastn 和 Blastp 进行基因序列和蛋白质序列相似性分析。利用 DNAMAN 预测蛋白质的分子量和等电点，在http://www.cbs.dtu.dk/ services/TatP/ 网站中进行信号肽预测，将 DNAMAN 翻译的蛋白质序列输入http://web.expasy.org/protsca- le/ 网站，分析预测的蛋白质疏水性，保守结构域在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi 上分析，利用DNAMAN构建系统发育树。

3.5 植物超表达载体的构建

参照天根质粒小提试剂盒说明书提取pMD18- T-AhCDPK32 和 pCambia2300EC 质粒，分别用BamHⅠ(Thermo 公司)切割，酶切体系分别为，pMD-18-T-AhCDPK32 17 μL，10 × Green Buffer 2.0 μL，BamHⅠ1 μL；pCambia2300EC 16 μL10×Green Buffer

2.0 μL，BamHⅠ 1 μL。水浴酶切 5 min，将含有 BamHⅠ 酶切位点的目的基因 AhCDPK32 和载体片段 pCam- bia2300EC 连接。连接体系如下：Solution I 5 μL，AhCDPK32 4 μL，pCambia2300EC 酶切产物 1 μL， 16℃连接5 h，构成 pCambia2300EC-AhCDPK32。将连接产物转化Trans-1 感受态细胞，转化方法同转化pMD18-T-AhCDPK32，最后涂在含有卡那霉素 LB平板上，菌落 PCR 鉴定后，选取阳性克隆进行酶切鉴定和测序鉴定。

作者贡献

张青云、孙全喜、唐月异、王秀贞、吴琪是本研究的实验设计和实验研究的执行人；张青云、王云云、曹广英、祁雪完成数据分析及论文初稿的写作；王传堂、孙全喜是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家花生产业技术体系(CARS-15)、山东省农业科学院科技创新重点项目(2014CGPY09)和山东省农业科学院青年科研基金 (2016YQN17; 2015YQN13)共同资助。

参考文献

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2.153

00035

豆科基因组学与遗传学

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